问题 可能原因 解决办法
高背景信号 洗板不充分 将洗涤缓冲液加入孔中洗涤,确保孔区域洗涤充分
确保已在洗涤前弃去了所有残留的抗体溶液
增加洗涤次数
链亲和素-HRP结合物过量 检查偶联物的稀释度,在推荐的稀释度下使用
封闭不充分 检查封闭液
延长封闭时间
孵育时间过长 缩短孵育时间
样品或标准品中含干扰物质 设置适当对照
缓冲液受污染 新鲜配置缓冲液
无信号 试剂添加顺序错误或试剂配制不正确 重复实验
检查试剂配制方法
复核试验试剂添加流程
HRP被叠氮化合物污染 使用新鲜配制的试剂
抗体用量不足 检查是否使用了推荐的抗体量
增加抗体用量(浓度)
使用了含胎牛血清的缓冲液复溶抗体 检查使用的试剂
捕获抗体与板结合较差 使用ELISA板,而非组织培养板
使用不含其它杂蛋白的PBS溶解抗体
缓冲液受污染 新鲜配置缓冲液
整板呈规则蓝色 洗板不充分或跳过洗涤步骤未去除残留的非结合过氧化物酶 严格按照说明书洗涤流程操作
底物溶液预混太早不新鲜 底物溶液混合后须立即使用
封板胶纸或试剂储液槽重复使用导致HRP残留污染 每步均需使用新的封板胶纸或试剂储液槽
缓冲液有金属或HRP污染 新鲜配置缓冲液
标准曲线不佳 梯度不明显 (值低或曲线平直) 链亲和素-HRP结合物量不足 检查倍性稀释是否正确
捕获抗体与板结合较差 使用酶标板,而非组织培养板
使用不含其它杂蛋白的PBS溶解抗体
检测抗体量不足 检查稀释度是否正确
孵育时间不足 延长底物溶液孵育时间
实验操作流程有误 严格按照说明书操作流程
标准曲线稀释计算错误 重新计算制作新的标准曲线
板内重复性差 洗板不充分 将洗涤缓冲液加入孔中洗涤,确保孔区域洗涤充分
确保已在洗涤前弃去了所有残留溶液
酶标板包被不均匀 检查封闭步骤是否正确
使用酶标板,而非组织培养板
使用不含其它杂蛋白的PBS溶解抗体
重复使用封板胶纸 每步均需更换使用新的封板胶纸
未使用封板胶纸 须使用封板胶纸
缓冲液受污染 新鲜配置缓冲液